沐足排钟管理器:RHA阳性 是怎么回事

人细小病毒B19感染及其诊断进展
　　人细小病毒B19(human parvovirus B19，简称B19)，1975年Cossart等〔1〕在筛选献血员乙型肝炎抗原时发现，是已知唯一对人类致病的细小病毒，无胞膜、耐热，直径23 nm，基因组为线性单链DNA分子，约5.5 kb。基因组右侧编码两个结构蛋白VP1(84K)和VP2(58K)，两者分别占整个衣壳蛋白的4%和96%，除了在VP1氨基末端有一227个氨基酸的独特区外，结构相同。左侧编码一个非结构蛋白(77K)。B19病毒感染的靶细胞是人骨髓祖代红细胞，病毒受体是红细胞P抗原。

　　B19感染多发生在秋末、春季和夏初，几乎呈世界范围分布。病毒可通过呼吸道和输用感染的血液或血制品传播，潜伏期为6～8天。B19可引起许多临床表现，因感染个体的年龄和免疫状态而不同，从无症状感染到严重者可危及生命。在儿童中可引起传染性红斑；特别是在成年妇女可引起短暂的多关节炎或关节痛；孕期感染B19可引起自然流产和胎儿水肿或死产；在潜在红细胞缺陷如镰刀型细胞贫血病人，B19可引起严重的再生障碍危象；持续细小病毒感染可导致慢性骨髓障碍，在免疫缺陷病人导致慢性贫血〔2〕；最近还报道B19感染与急性肝炎有关〔3〕。

　　B19病毒的特性使其很难被某些理化方法破坏，输注经某些灭活病毒方法处理的血制品后，仍可发生B19感染，至今尚无有效的去除和/或灭活该病毒的办法。B19在供血者中的阳性率约为0.004%～0.6%〔4〕。因此对献血员以及上述特殊人群进行B19感染的筛选及检测具有重要意义。下面就B19感染诊断方面的研究作一综述。

　　一、抗体检测(IgG、IgM)

　　诊断B19近期感染最敏感的试验是IgM抗体检测。大约90%的病人在症状出现后3天即可通过酶免疫试验检测到B19的IgM抗体，抗体的阳性率和滴度在发病后30～60天后开始下降。B19IgG抗体通常在发病后7天出现，持续数年〔5〕。

　　Anderson等〔6〕首次建立了检测B19特异IgM的试验；1983年Cohen等〔5〕描述了采用单克隆抗体诊断B19感染的IgM抗体捕获放射免疫试验(MACRIA)，该试验被作为参考试验。所有这些B19-IgM检测试验使用的均是直接从急性感染的、有一过性严重病毒血症期的供血者血清中分离的病毒抗原。但由于病毒血症发生率非常低，大约1/1 000〔7〕，通常短暂且发生于症状之前，因此病毒从血清中的分离有赖于供血者血清的随机筛选。又由于该病毒的极端的组织亲和性(红细胞系统)，至今对B19病毒尚无实用的体外组织培养系统，缺乏大量生产B19抗原的理想方法。虽然曾建立了B19在人骨髓原代细胞和人胎肝红细胞系统的体外繁殖B19病毒系统，但均因细胞应用的局限性以及病毒产量低，不适用于抗原的大规模生产。抗原的严重缺乏，极大地限制了B19血清学诊断的广泛应用和疫苗的研究。为此，人们把注意力集中到利用重组DNA技术生产抗原上。重组抗原的应用将改善B19感染的诊断，使得就地筛选成为可能，结果快速，并较使用全病毒更安全，提供了B19抗原可靠而均一的稳定来源。

　　80年代后期起B19抗原在几种系统中得到成功表达，主要有大肠埃希菌、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞以及杆状病毒-昆虫细胞表达系统。在杆状病毒感染的昆虫细胞中表达的重组VP1和VP2能够自我组装成类似于天然病毒的空衣壳，这对于保持其抗原性有重要意义，可取代天然抗原，更便于B19病毒抗体的检测。Salimans等〔8〕研究了B19病毒空衣壳在检测B19特异的IgG和IgM抗体中的应用。对30份在以天然病毒为抗原的RIA检测中IgG/IgM阳性的血清进行测定，结果在ELISA滴度和RIA值之间有很好的相关性。以VP2和VP1-VP2抗原检测的敏感性和特异性均达到90%以上，该系统生产B19抗原，纯度高而且易于大规模生产，具有广阔的应用前景。Cubie等〔9〕对重组蛋白在检测B19IgG/IgM的不同血清学试验中的敏感性、特异性和实用性进行了研究，包括间接ELISA(rELISA-G和rELISA-M)和间接免疫荧光试验(IFA-G和IFA-M)。以经典的天然病毒为抗原的抗体捕获放射免疫试验(GACRIA和MACRIA)为参照试验。结果rELISA-G和IFA-G的敏感性分别为92%(77/84)和97%(68/70)。在检测B19IgM的试验中，两种采用重组蛋白的试验的敏感性均大于95%。rELISA-M的敏感性好，IFA-M的特异性好且结果准确，两者结合起来诊断近期B19感染很有意义。Schwarz等〔10〕采用天然B19病毒抗原的μ链-捕获试验与采用重组抗原的免疫印迹试验(rec-IB)和重组ELISA(rec-ELISA)进行比较，结果表明：rec-IB的敏感性和特异性分别为94.3%和96.4%，rec-ELISA为94.3%和72.7%。捕获法和rec-IB的一致性为87.8%，与rec-ELISA的一致性仅为74.4%。对于急性B19感染的病人检测抗B19-IgG，rec-IB的敏感性为94.3%，rec-ELISA的敏感性为85.7%。提示对于急性B19感染的诊断，rec-IB比rec-ELISA更可靠。

　　1992年Brown等〔11〕报道B19能凝集灵长类动物红细胞，但对血浆来源的病毒，该活性被其中存在的类似IgM抑制因子所掩盖。而在重组杆状病毒感染的S f 9细胞中表达的B19病毒蛋白能强烈凝集狒狒的红细胞。基于这些发现，Cubel等〔12〕建立了抗体捕获的血细胞粘附试验(antibody capture hemadherence test)以检测细小病毒B19的IgM(MACHAT)，该法与天然抗原—MACEIA的符合率为96%，且更为敏感。在应用上，MACHAT比MACEIA具有明显的优势，因为猴红细胞取代了单克隆抗体和酶标抗体，作为指示系统，更便于操作。

　　对B19单一结构蛋白的IgG亚类水平和反应动力学的研究表明，在阳性个体血清中，对VP1和VP2，主要存在的亚类是IgG1；IgG3亚类与B19急性感染密切相关；而IgG4出现在感染数月后且为VP1所特异；VP1特异IgG3与IgG4之比对诊断近期感染很有意义，特异性98%，敏感性97%〔13〕。

　　为改善B19感染的诊断并鉴别原发和继发感染，Soderlund等〔14〕建立了以不同重组抗原为基础的蛋白-变性IgG亲和力EIAs。结果显示，以VP1蛋白抗原为基础的IgG亲和力测定试验高度敏感特异，适于B19近期和原发感染的鉴别。急性期感染以低亲和力抗体为主，随感染后时间的推移，抗体成熟，亲和力增高。对于近期B19感染，抗体亲和力试验比IgM检测更敏感、更方便。IgM通常持续2～3个月，低亲和力IgG抗体持续1～2个月。IgG亲和试验与传统的血清学诊断方法一起使用，将改善B19再次感染的诊断并能监测在高危情况下如溶血性疾病或孕期时的感染情况。进而，在有症状病人或有与B19病因学诊断一致发现时(如DNA或IgM阳性)，该试验能鉴别急性和慢性感染。蛋白-变性免疫试验是一个新技术，测定IgG抗体的抗原亲和力(功能亲和力)，以逐渐增加的IgG结合力作为抗体反应成熟的指标，可区分近期原发感染和既往感染，包括再次感染、内源再次激活或外源再次感染。

　　综上所述，在以检测B19抗体为基础的上述诊断方法中，各具优势和不足，但就采用的B19抗原来说，以重组基因抗原取代天然抗原势在必行，是能否广泛开展B19感染诊断的关键。

　　二、抗原和DNA检测

　　儿童中对B19的IgM免疫应答有个很特别的现象。在有出疹(传染性红斑)的成人中B19-IgM反应非常强，但在有同样临床症状的儿童(＜13岁)中却很弱。然而当患有溶血性贫血的该年龄组儿童感染B19病毒并发生再生障碍危象时，IgM反应特强。因此，尽管在成人依靠IgM诊断是可靠的，但在儿童中，只有在特殊情况下可依靠IgM反应进行诊断，这些IgM反应不同的原因可能与B19病毒血症的强度有关。因此，IgM检测对于儿童急性感染的诊断可能并不是一个可靠的手段〔15〕。此外，免疫抑制也可使B19抗体丢失，以及再次出现病毒血症。因此在免疫缺陷病人的慢性B19感染诊断，可能检测不到B19抗体，需进行B19DNA或病毒抗原的检测。

　　检测病毒最敏感的手段是核酸杂交。该试验被用于鉴别血清、白细胞、呼吸道分泌物、尿和组织标本中的B19DNA。由于在检测不出病毒血症情况下，B19可在骨髓细胞中长期存在，原位杂交对于特定病毒核酸在细胞中的定位很有意义。Musiani等〔16〕建立了原位杂交化学发光法通过免疫酶反应检测骨髓细胞中的B19病毒DNA，结果特异，敏感性高于比色法原位杂交。该法仅需少量细胞即可诊断B19感染，而不必抽提病毒核酸，不需要B19感染的分子方面的资料，在研究和诊断上具有广泛的应用价值，对于监测慢性感染中B19在骨髓细胞中的持续复制很有意义。Gentilomi等〔17〕建立了一个简便、快速的免疫过氧化物酶斑点试验，直接检测人血清中的B19衣壳抗原。只需将血清标本点到尼龙膜上，再用抗B19衣壳蛋白VP1和VP2的单抗，通过免疫过氧化物酶染色复合物，即可检测出该二抗原。试验可在4小时内完成。作者检测了541份血清标本，结果与斑点杂交和巢式聚合酶链反应(PCR)可比。其敏感性较斑点杂交法高，但较巢式PCR法稍低。由于该方法的敏感性水平适合急性B19感染的检测，以及从试验花费、时间和试验实用性考虑，作者认为该法特别适用于样品的大规模筛选，并可替代常规实验室评价B19感染时的DNA检测方法。

　　以往在献血员筛选中主要采用PCR方法，但该法检测出的阳性不能区分样本中的病毒体是否具有感染性，它可以检测出灭活的或变性的病毒。Sato等〔18〕基于B19受体是红细胞P抗原的特性，建立了快速敏感的用于大规模筛选献血员B19的功能性的方法-B19病毒受体介导的血凝试验(RHA)，该法与PCR相比，简便、快速且经济实惠，其最高敏感度约为每毫升105～106拷贝个病毒基因组，按半定量PCR计算，比双向免疫扩散(DID)要敏感10 000到100 000倍，敏感性比PCR小100到1 000倍。但与PCR不同的是，RHA检测出的只是那些能与受体分子结合的(功能性的)病毒粒子。在检测献血员标本时，未发现任何PCR阳性而RHA阴性的样本。研究表明RHA对于检测有病毒血症的献血员，其敏感性和特异性是足够的。

　　由于细小病毒B19对人致病的广泛性和复杂性，目前，国际上对该病毒的研究比较活跃，包括其致病性及相关疾病的研究、临床及实验室诊断、分子及血清流行病学研究、感染的预防和治疗、疫苗的研制等。相信随着社会经济文化的进步，人们的生活水平以及对健康认识的提高，细小病毒B19会越来越引起人们的重视。